Prerazporeditev RNA-vezavnih proteinov v proteinopatijah TDP-43

Avtorica:

Ana Mištrafović

Mentorica:

Eva Šajn

Somentorja:

: Jerneja Nimac, mag. biokem., Inštitut Jožef Stefan, prof. dr. Boris Rogelj, Inštitut Jožef Stefan

Ključne besede:

TDP-43, ALS, celična frakcionacija, prerazporeditev interaktorjev

Povzetek:

TAR DNA vezan protein 43 (TDP-43) je jedrni protein, ki je vključen v mehanizme RNA, povezane s transkripcijo in posttranskricpijskim spreminjanjem pre-mRNA in mRNA. Regulira izrezovanje intronov in prepisovanje mRNA. Skrbi za stabilnost mRNA, vpliva na razpolovni čas mRNA ter pomaga pri transportu mRNA. V teh procesih TDP-43 sodeluje z drugimi proteini. Mutacije tega proteina so pogosto prisotne pri bolnikih z nevrodegenrativnimi boleznimi. Proteinopatija TDP-43 je prisotna pri 97 % bolnikov z amiotrofično lateralno sklerozo (ALS). Značilen znak te patologije je napačna lokalizacija proteina TDP-43 (iz jedra v citoplazmo). V raziskovalni nalogi smo želeli s celično frakcionacijo preučiti, ali pride do prerazporeditve interakcijskih partnerjev proteina TDP-43 iz jedra v citoplazmo v primeru, ko je prisoten mutant TDP-43dNLS. Pred izvedbo celične frakcionacije smo pod fluorescenčnim mikroskopom opazovali inducibilne ekspresijske celične linije HEK 293, ki izražajo divji tip proteina TDP-43 v fuziji s KO2, protein TDP-43 brez jedrnega lokalizacijskega signala (NLS) v fuziji s KO2 oziroma le rdeči fluorescenčni protein KO2. Določili smo, da se fuzija TDP-43wt-KO2 nahaja v jedru, medtem ko se fuzija TDP-43dNLS nahajala v citoplazmi. Sledila je priprava jedrne in citoplazemske frakcije celic, ki so izražale TDP-43wt-KO2, TDP-43dNLS-KO2 in le KO2. S prenosom western, ki mu je sledila imunodetekcija, smo v frakcijah določili količino NONO, SFPQ in ATXN2L. V sklopu raziskovalne naloge smo želeli z imunohistokemijsko analizo preučiti tudi lokalizacijo proteinov NONO, SFPQ in ATXN2L v motoričnem korteksu zdravih miši. Ugotovili smo, da se NONO in SFPQ nahajata v jedru in kolokalizirata s TDP-43, medtem ko se ATXN2L nahaja v jedru in s TDP-43 ne kolokalizira.